hiv感染的实验室检测现状
艾滋病是严重威胁我国人民健康的疾病之一，目前在我国流行趋势依然严峻。卫生部、联合国艾滋病规划署和世界卫生组织联合评估显示，截至2009年底，累计报告艾滋病病毒感染者和艾滋病病人32.6万例，其中艾滋病病人10.7万例，死亡报告5.4万例，估计中国存活艾滋病病毒感染者和病人约74万人，其中艾滋病病人为10.5万人。HIV感染的实验室检测在HIV感染的诊断、疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药监测中至关重要，是艾滋病防治工作的重要基础。目前临床检测内容包括HIV抗体、P24抗原、HIV病毒载量、HIV耐药检测、CD4+T淋巴细胞计数等。为满足目前艾滋病检测工作的实际需要，2009年9月中国疾病预防控制中心颁布了《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》，对2004年版的内容进行了修改、增补和完善。HIV的检测必须遵守国家制定的《艾滋病检测工作管理办法》和《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》（以下简称《规范》），严格进行。
一、HIV抗体检测
HIV抗体检测不同于其他病原微生物的检测，任何错误的诊断，包括假阳性或假阴性，都会对被检者甚至他人造成重要的影响。因此，HIV抗体检测必须严格按照《规范》要求，由接受过专门技术培训并获合格证书的技术人员在当地卫生行政部门审批合格的实验室中进行，整个实验过程应有严格的质量保证体系。
HIV抗体检测分为筛查试验和确证试验，可用于诊断（确定个体HIV感染状况）、监测（了解不同人群HIV感染率及其变化趋势）及血液筛查（防止输血传播HIV）。筛查试验根据检测原理不同分为酶联免疫吸附法、凝集法和层析法，可对血液、唾液和尿液标本进行常规或快速检测。临床用于血液筛查的方法包括酶联免疫试验（ELISA）、免疫荧光法、化学发光法等，常用的为酶联免疫法（ELISA）。自1985年第一代ELISA试剂问世以来，随着医学技术的发展，包被抗原已从一代的全病毒裂解物发展为目前以基因重组和多肽抗原包被和标记、有着良好敏感性和特异性的三代双抗原夹心试剂，检测亚型包括HIV-1、 HIV-2和HIV-1型的O亚型。第四代ELISA可同时检测P24抗原和HIV-1/2抗体，进一步缩短了窗口期。此外，按《规范》要求，快速检测由于简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测，包括明胶颗粒凝集试验、斑点ELISA、斑点免疫胶体金快速试验、艾滋病唾液检测卡等。对用ELISA试剂或快速诊断试剂进行的筛查实验如呈阴性反应，即报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，筛查实验室应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监督管理局（SDA）注册批准、批检合格、在有效期内、推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性均高的试剂。
HIV抗体筛查呈阳性反应的标本由于存在假阳性的可能，必须进行确证试验。其方法包括免疫印迹试验、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验及免疫荧光试验，目前以免疫印迹试验最为常用。确认试剂必须是经SDA注册批准、在有效期内的试剂。免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型，按《规范》要求，先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，根据《规范》中判定免疫印迹试验结果的基本原则并参照所用试剂说明书综合判定，无HIV抗体特异带出现的报告HIV抗体阴性；出现HIV抗体特异带，符合HIV-1抗体阳性判定标准，则报告HIV-1抗体阳性。如出现HIV-2型的特异性条带，需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2型抗体确证试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应的则报告HIV-2抗体血清学阳性，如需鉴别应进行核酸序列分析。如果出现HIV抗体特异带，但不足以判定为阳性，则判为HIV抗体不确定。对HIV抗体不确定者，新版《规范》修改了随访的时间，将3个月的随访周期缩短为4周，要求在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现符合判定标准的HIV-1抗体阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。第8周时如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。
为确保HIV抗体筛查的准确性，在所有实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清。内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清，是质量控制的基础，每次检测必须使用内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。外部对照质控血清是由实验室设置的弱阳性对照，一般以该试剂盒临界值（Cut off）的2-3倍为宜，可购买或由实验室自己制备。此外，全国各艾滋病筛查实验室需参加本省艾滋病确认中心实验室组织的室间质量评价，各艾滋病确认中心实验室和艾滋病确证实验室需参加国家艾滋病参比实验室组织的室间评价，以确保HIV抗体检测质量。
二、HIV-1 P24抗原检测
HIV-1 P24抗原检测可用于HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断；HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断。P24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂，试剂必须经过SDA批准注册、在有效期内，其阳性结果必须依据试剂说明书经中和试验确认。HIV-1P24抗原检测的敏感性为30-90%，该结果仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊；HIV-1 P24抗原检测阴性只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染，临床中一般不作为常规诊断项目。
三、HIV RNA定量测定（病毒载量检测）及HIV核酸定性检测
HIV核酸检测可用于HIV感染的辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效判定、预测疾病进展等。常用的HIV病毒载量检测方法包括逆转录PCR实验（RT-PCR）、核酸序列扩增实验（NASBA）、分支DNA杂交实验（bDNA）以及实时荧光定量PCR技术。值得注意的是，每一种HIV
RNA定量系统都有其最低检测限，即可以测出的最低拷贝数或国际单位，RNA定量检测时未测出不等于样品中不含有病毒RNA，因此HIV核酸定性检测阴性，只可报告本次实验结果阴性，但不能排除HIV感染；HIV核酸检测阳性，可作为诊断HIV感染的辅助指标，不能单独用于HIV感染的诊断。报告HIV核酸定量检测结果时应按照仪器读数报告结果，注明使用的实验方法、样品种类和样品量，当测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。
HIV核酸定性检测也可用于HIV感染的辅助诊断，目前在分析HIV基因亚型和变异等基础研究中应用。通常使用PCR或RT-PCR技术，使用分子生物学实验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量覆盖所有或常见的毒株，也可使用复合引物。报告定性检测结果时应注明反应条件和所使用的引物序列。此外，利用核酸检测方法的高度敏感性，使用集合核酸扩增检测技术和方法，对高度怀疑感染人群且抗体阴性的样品进行集合核酸检测，可及时发现窗口期感染者。该方法较单份样品的核酸检测具有更高的成本效益。
四、CD4+ T淋巴细胞计数
CD4+T淋巴细胞是人体免疫系统最重要的细胞之一。HIV以CD4+T淋巴细胞为靶细胞，感染后可导致CD4+T淋巴细胞进行性下降，使机体免疫功能受损，最终因机会性感染及肿瘤而死亡。CD4+T淋巴细胞绝对值的检测在HIV感染的以下方面发挥了重要作用：了解机体的免疫状态以确定疾病分期、监测疾病进程、评估疾病预后、制定抗病毒治疗及机会性感染预防性治疗方案及评估抗病毒治疗疗效等。目前用于CD4+T淋巴细胞检测的方法分为自动检测方法和手工操作法。自动检测方法包括流式细胞仪（单平台一步法、多平台三级程序法）和专门的细胞计数仪，手工操作方法则需要显微镜或酶联免疫试验设备。目前检测CD4+T淋巴细胞数的标准方法为流式细胞仪，可得出CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的绝对值及占淋巴细胞的百分率。为确保检测的准确性，应制定质量保证计划，建立内部质量控制制度，并参加室间质量评价。
五、抗病毒治疗的耐药监测
高效抗逆转录病毒治疗为目前针对HIV最有效的治疗，但由于HIV可产生自发性高频率的基因突变，在抗病毒药物选择性压力下，HIV的突变可促使HIV耐药株的产生，并进一步引起多种药物交叉耐药，成为遏制AIDS流行的主要障碍之一。目前常用的耐药检测方法包括基因型和表型HIV耐药检测。当病毒对某些药物产生耐药时，病毒基因会发生一些明确的突变，因此，可应用病毒耐药基因型的检测预测某些药物的治疗效果。其方法为从患者血液标本中分离HIV核酸物质，进行核酸序列分析，确定与耐药性相关的病毒变异位点。在确认变异后，与既往耐药或交叉耐药研究比较，间接地估计药物耐药情况，简单快速，费用低，结果分析较复杂，需由专业人员进行。基因型耐药检测方法有时并不能解释某些耐药突变之间的相关性，如各突变之间是否有协同或者抵抗作用。目前我国进行的耐药性检测主要为基因型耐药检测。卫生部指导建立的全国HIV耐药性监测网络可及时掌握耐药毒株出现的情况以及影响因素，为国家HIV抗病毒治疗提供了技术保障。表型HIV耐药性检测包括传统的共培养方法和重组病毒表型检测方法，能直接测出感染毒株对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-1 感染者有效地用药。不足之处为试验慢且费用昂贵，技术要求高，多种影响因素导致重复性差，多需在P3级生物安全实验室中进行，因此，其在临床上的应用受到限制。
六、HIV病毒分离
HIV病毒培养及分离可用于HIV-1感染的辅助诊断。HIV病毒分离需要在P3级生物安全实验室进行，实验条件及技术要求较高，目前多用于HIV相关的科学研究。
综上，随着我国艾滋病防控力度的不断加大，对于监测和检测技术的要求也不断提高，艾滋病检测工作量日趋增加。在现有基础上进一步完善实验室检测的技术及质量控制，满足国家艾滋病防治对于监测检测工作的要求，是从事艾滋病检测工作人员义不容辞的责任。
